牛結節(jié)性皮膚病病毒檢測試劑盒（實時熒光PCR法）如何操作
【產品名稱】
通用名稱：牛結節(jié)性皮膚病病毒檢測試劑盒（實時熒光PCR法）
英文名稱：Lumpy skin disease virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】 25T/盒 ＆ 50T/盒
【預期用途】
本試劑盒利用實時熒光PCR原理，定性檢測LSDV，對LSDV引起的牛的疫病的診斷和監(jiān)控具有重要指導意義。
【檢驗原理】
本試劑盒針對LSDV高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針，在反應體系中含LSDV基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，實現檢測結果的定性分析。
【主要組成成份】
序號 | 組成 | 25T/盒 | 50T/盒 |
1 | LSDV PCR反應液 | 500 μL×1管 | 1000 μL×1管 |
2 | LSDV 陽性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
3 | LSDV 陰性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
4 | 說明書 | 1份 | 1份 |
注：陰性對照為滅菌純水，陽性對照為含牛結節(jié)性皮膚病靶基因的質粒。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler 480、西安天隆系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1. 樣品采集及處理
1.1 患畜液體樣品：無菌采集抗凝血或血清、精液或細胞懸浮液5 mL。
1.2 患畜組織樣品：包括皮膚、肺、脾臟、淋巴結、肌肉等組織樣品。2~8℃低溫運輸至實驗室用于檢測。
2. 樣品處理方法
2.1 組織樣品：包括皮膚、肺、脾臟、淋巴結、肌肉等。取2g-5g組織樣品切成小塊，加入5ml-10ml預冷的PBS緩沖液勻漿2min，制成懸液，反復凍融3次，4℃ 5000r/m離心10min，取上清液待檢；
2.2 液體樣品：抗凝血樣品置離心管中，掌上離心機離心2 分鐘取上層血漿，待檢。非抗凝血樣品置離心管中，待凝固后，掌上離心機離心2 分鐘取上層血清，待檢。
2.3 標本收集后若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應凍存于-20℃～-80℃；
標本保存期間應避免反復凍融。
【檢驗方法】
1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當次實驗所需要的反應數（n），并根據如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數（1T）+陽性對照數（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數
單反液配制表(每份) | PCR反應液（UNG酶及Taq酶） | 20 μL |
（3）在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。
（4）蓋緊PCR反應管蓋后將PCR反應管轉移至樣本處理區(qū)。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。
2.樣本準備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本DNA各5μl、終體積25μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。
4. PCR（PCR擴增區(qū)）
反應體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集LSDV熒光信號 |
PCR 反應 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數 |
UNG處理 | 37℃：2分鐘（min） | 1 | |
預變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
PCR擴增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
58℃：40秒（s） （此階段結束時采集熒光信號） |
（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設置儀器核酸擴增相關參數進行PCR擴增。
注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數增長期。
2.標本結果判定：
（1）陽性：標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數增長期。
（2）可疑：標本檢測結果Ct值在35～38范圍內。此時應對標本進行重復檢測，如重復實驗結果Ct值仍在35～38范圍內，有明顯指數增長期，則判定為陽性，否則為陰性。
（3）陰性：標本檢測結果Ct值＞38或無Ct值。
【檢驗結果的解釋】
通道及檢測結果 | 標本檢測結果解釋 |
FAM | |
陰性（－） | 標本中未檢出LSDV |
陽性（＋） | 標本中檢測出LSDV |
【檢驗方法的局限性】
1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會發(fā)生假陰性的結果。
2. 本試劑盒僅供標本初步篩查使用，對于本試劑盒檢測陽性結果應進一步使用培養(yǎng)法進行確診。
【產品性能指標】 產品的最di檢出限為103Copies/mL，產品CV值≤3%。
【注意事項】
1. 使用本試劑盒的實驗室，應嚴格按照國家有關部分頒布的有關基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理；
2. 為避免RNA降解，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應經過無核酶處理；
3. 各區(qū)域物品均為專用，不得交叉使用，以免污染；檢測結束后，應立即對工作臺清潔；
4. 吸取反應液時，應盡量避免產生氣泡；上 PCR 儀前，應注意檢查各反應管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結果不準確；
5. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時離心；
6. 試劑盒內所配陰性和陽性對照在第一次使用前應全部轉移至標本準備區(qū)，并單獨存放；
7. 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進行任何標記；
8. 檢測過程中使用過的吸頭，應直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內，檢測結束的PCR 反應管，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄；工作臺及各種實驗用品應定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進行消毒；
9.儀器擴增相關參數應按照本說明書相關要求進行設置；不同批號試劑不能混用；并在有效期內使用。
